Sammanfattning av slutrapport
Övre luftvägsinfektioner är den huvudsakliga orsaken till prestationsnedsättning hos hästar. Förbättrad diagnostik för sådana infektioner, både för virus och bakterier, är ovärderlig för hästnäringen. Kvarka, en av de viktigaste orsakerna till luftvägsproblem, är mycket smittsam, med ca 50 utbrott rapporterade årligen i Sverige. Inom projektet utvärderades nya tekniker för att provta, analysera (PCR, serologi), och smittspåra (molekylär typning) på sjuka, konvalescent och friska hästar. Dessutom utvärderades diagnostiska plattformar som enkelt ska kunna användas av kliniker och veterinärer, för detektion av patogener från hästens luftvägar. Resultat visar på både möjligheterna och svårigheterna med att hitta en bra plattform. Affärsmässiga partnerskap är avgörande för utveckling och implementering; de etablerade samarbeten som finns kommer att fortsätta. Prisvärda integrerade molekylära plattformar finns ännu inte på marknaden, men en prototyp testades.

Populärvetenskaplig sammanfattning
Subkliniska luftvägsinfektioner hos häst – H1047308

Syfte med studien
Luftvägsinfektioner är en viktig orsak till prestationsnedsättning hos sporthästar. Kvarka är en mycket smittsam hästsjukdom orsakat av bakterien. Streptococcus equi med ca 50 anmälda svenska utbrott per år, där varje utbrott vanligen omfattar flera hästar. Kvarka orsakar stora kostnader då stall som drabbas ofta hålls isolerade under lång tid. Negativa effekter efter genomgången sjukdom är lite studerat, det har saknats verktyg för att studera korrelation mellan prestation och genomgången kvarkainfektion. I tidig infektionsfas, eller vid subklinisk eller atypisk infektion, är det svårt att skilja mellan virusorsakad infektion och kvarka. Efter att hästarna tillfrisknat finns ofta kliniskt friska smittbärare och bakterien kan gömma sig i luftsäckarna. Hur detta påverkar hästens hälsostatus eller prestation är lite studerat. Vid ett doktorandprojekt vid SVA/SLU (finansierat av Formas och Stiftelsen Hästforskning) har diagnostiken förbättrats avsevärt genom förbättrad provtagning i fält och förbättrad diagnostik på laboratoriet, inkluderande realtids-PCR (Lindahl et al., 2013).

Viktig ny forskning pekar ut varianter av den närbesläktade bakterien Streptococcus. zooepidemicus som möjlig orsak till kvarka-liknande sjukdom. S. zooepidemicus kan isoleras hos en andel friska hästar, och kan också vara orsak till luftvägssymptom. S. zooepidemicus är en genetiskt mycket heterogen grupp av bakterier, och vissa grupper verkar vara starkare kopplade till olika kliniska symtom. Detta till skillnad mot S. equi som är en genetiskt homogen grupp av bakterier. Förbättring och effektivisering av dagens diagnostik för kvarka skulle vara av stort värde för näringen.

Syftet med projektet var att ta fram verktyg för att begränsa spridningen av kvarka. Diagnostiska verktyg (serologi för antikroppar mot kvarka och molekylärbiologisk analys av kvarkastammar) utvärderades för att åstadkomma begränsning av smittspridning under och efter utbrott. Målet för projektet sammanföll med målen för virusprojektet ”Betydelsen av lågvirulenta virus och subkliniska luftvägsinfektioner hos svenska och norska travhästar” men nu med S. equi och S. zooepidemicus som differentialdiagnoser, för att få en så fullständig bild som möjligt av subklinisk infektionsdynamik hos prestationsnedsatta travhästar. Ett mål var också att etablera ett system för att påvisa de viktigaste infektiösa (virala och bakteriella) luftvägspatogenerna i Sverige vid point of care (i stallet) eller vid en hästklinik.

Resultat
Resultaten visade att friska hästar från besättningar utan historia av kvarka var sällan positiva för antikroppar mot S. equi. Hästar med kliniska symtom på kvarka hade i ca 40% av fallen hunnit bilda antikroppar mot S. equi under den akuta sjukdomsfasen. Efter att hästar hade tillfrisknat efter kvarkautbrott var antikroppstitrarna ofta positiva, vilket var förväntat. Vissa av dessa hästar var subkliniska smittbärare av kvarka. Titern klingade i de flesta fall av under månaderna efter sjukdomsutbrottet. Hästar som visade kvarka-liknande symtom men hos vilka endast S. zooepidemicus påvisades hade inga antikroppar mot S. equi. Detta styrkte att hästarna ej hade kvarka och de kunde därmed friförklaras.

Typning av S. equi visar att SeM-59 var den vanligaste typen hos svenska hästar under den aktuella perioden, och tycks också ha gett upphov till tre nya, närbesläktade varianter (C,F,G). På samma sätt tycks A och B vara nära besläktade med den tidigare kända typen SeM-7.

Samtliga nässvabbprover från varmblodiga travhästar i träning var negativa avseende S. equi och 11% av proverna var positiva för S. zooepidemicus med real-tids PCR. Resultaten bearbetades i en databas där prestationsnedsättning hos varmblodiga travhästar studerades. Det fanns inte någon korrelation mellan fynd av S. zooepidemicus och nedsatt prestation (skattad av tränaren) eller nedsatt prestation vid arbetsprov med sulky (över mjölksyranivå).

Två strategier för utveckling av ”Point of care” diagnostiska plattformar testades: en portabel och en för stationärt bruk. Kommersiella partners rekryterades för att hjälpa till att utveckla lämpliga tester och utrustning. Provtagningen följde den rekommenderade metoden med e-svabb. För att extrahera det genetiska materialet utvecklades och/eller testades manuella och automatiserade metoder. Olika molekylära genetiska teststrategier bedömdes: isotermisk (en reaktionstemperatur) och realtids-PCR (termocykling).

Metod
En iELISA-metod sattes upp för analys avseende antikroppar mot två olika antigen hos Streptococcus equi (kvarka) i hästens blod. Blodprover togs för antikroppsanalys från olika kategorier: friska hästar av olika ras, kön och ålder, hästar med kliniska symtom på kvarka, hästar som tillfrisknat efter kvarkautbrott och slutligen hästar som visade kvarka-liknande symtom men där endast S. zooepidemicus påvisades.

Streptococcus equi-stammar från svenska utbrott samlades in. En metod för karakterisering av stammarna på molekylär nivå genom sekvensering av genen för SeM-proteinet sattes upp inom projektet (Lindahl et al., 2011). Genen för SeM-proteinet sekvenserades hos de isolerade S. equi-stammarna. Vi jämförde resultat mellan stammarna och korrelerade med geografiska områden och olika utbrott i Sverige och med en internationell databas.

Nässvabbprover från varmblodiga travhästar i träning från olika stall analyserades avseende förekomst av S. equi och S. zooepidemicus med real-tids PCR.

För ”Point of care” diagnostiska plattformar utvecklades testreagens som var färdigblandade och därmed lätta att använda, bland annat ett torkat kit för influensa. Den portabla plattformen bestod av bärbara realtids-PCR instrument, T-COR 4 och en manuell extraktion. Den stationära plattformen (geneLEAD), en allt-i-ett extraktions- och detektionsplattform visade sig vara den mest lovande för integrering i klinisk veterinärmedicinsk praxis. Partnerskap med företag som är involverade i utvecklingen av dessa instrument och analyser inrättades och kommer att fortsätta.

Slutsatser med nytta för och råd till näringen
• Serologi för S. equi kan vara ett värdefullt verktyg vid smittspårning t.ex. för att söka efter exponerade hästar bland nyinköpta hästar eller vid ett utbrott. Serologi kan även användas för att utesluta kvarka vid kvarka-liknande sjukdom orsakat av S. zooepidemicus. Parprov kan krävas vid vissa frågeställningar. Sensitiviteten för antikroppssvar vid olika tidpunkter efter sjukdom kvarstår att utreda.
• Släktskap mellan stammar av S. equi kan identifieras med hjälp av SeM-typning och kan vara värdefullt för att övervaka kvarkaläget i Sverige och omvärlden.
• Tidig detektion av kvarka och andra luftvägspatogener är viktigt för framgångsrik begränsning av ett utbrott och därmed minska lidandet för hästar och användandet av antibiotika och ekonomiska konsekvenser för näringen. Utvecklingen för att ta fram diagnostik som kan användas i fält fortsätter.

Vetenskapliga referenser
Lindahl S, Båverud V, Egenvall A, Aspán A, Pringle J. Comparison of sampling sites and laboratory diagnostic tests for S. equi subsp. equi in horses from confirmed strangles outbreaks. J Vet Intern Med. 2013 May-Jun;27(3):542-7.
Lindahl S, Söderlund R, Frosth S, Pringle J, Båverud V, Aspán A. Tracing outbreaks of Streptococcus equi infection (strangles) in horses using sequence variation in the seM gene and pulsed-field gel electrophoresis.Vet Microbiol. 2011 Nov 21;153(1-2):144-9. Epub 2011 Mar 30.