Förbättrad kryoöverlevnad hos hingstspermier avsedda för artificiell insemination

Summering av slutrapport

Målen för projektet är att fastställa om seminalplasman (SP) har en betydelse för hingst spermiernas kryoöverlevnad och befruktningsförmåga. Seminalplasman har visat sig öka spermiers kryoöverlevnad hos andra arter, samt förlänga spermiers överlevnad i hondjuret. En cross-over-studie utfördes där SP från hingstar med god frysbarhet tillsatts spermier från hingstar med dålig frysbarhet och vice versa, följt av mätning av spermiekvalitet, kryoöverlevnad, och befruktningsförmåga med hjälp av en heterolog zona-bindningsmetod. Resultaten visade att borttagning av SP totalt gav bäst resultat; att tillsätta SP från hingstar med god frysbarhet gav ingen ytterligare förbättring. Att tillsätta SP efter upptining reparerade inte kryoskador. Bindning av spermierna till oocyter påverkas också av SP från hingstar med god frysbarhet; behandlade spermierna kan behöva mer tid för kapacitering innan befruktning. Resultaten har betydelse för optimering av protokoll för infrysning och inseminering.

Sammanfattning av ansökan

Det är fortfarande inte möjligt att frysa ejakulat från alla hingstar med bra resultat. Spermiernas överlevnadstid efter upptining är kort. Hos hingstar med jämförbar spermiekvalitet före infrysning kan skillnaden i spermiers kryoöverlevnad bero på att seminalplasman (SP) varierar. Målen för projektet är att fastställa SP betydelse för spermiernas kryoöverlevnad samt att mäta effekterna av tillsätta ”heat shock proteins” och prostasomer till spermier. Dessa komponenter ingår i sekret från könsvägarna hos hondjur och har visat sig öka spermiers kryoöverlevnad hos andra arter, samt förlänga spermiers överlevnad i hondjuret. En cross-over-studie utförs där SP från hingstar med god frysbarhet tillsätts spermier från hingstar med dålig frysbarhet och vice versa, följt av mätning av spermiekvalitet och kryoöverlevnad. Spermiernas befruktningsförmåga testas med en heterolog zona-bindningsmetod. Resultaten kommer att användas för att utveckla metoder för infrysning av hingstspermier.

Populärvetenskaplig redovisning

Det är fortfarande inte möjligt att frysa spermier från alla hingstar med bra resultat och spermiernas överlevnadstid efter upptining är kort. Hos hingstar med jämförbar spermiekvalitet före infrysning kan skillnaden i spermiers kryoöverlevnad bero på att deras seminalplasman (SP) varierar. Målen för projektet är att fastställa om seminalplasman (SP) har en betydelse för hingst spermiernas kryoöverlevnad och befruktningsförmåga. Seminalplasman har visat sig öka spermiers kryoöverlevnad hos andra arter och kan till och med reparera kryoskador till spermiemembraner.

En cross-over-studie utfördes där SP från hingstar med god frysbarhet tillsatts spermier från hingstar med dålig frysbarhet och vice versa, dvs

i. Spermier från hingstar med god frysbarhet + seminalplasman från hingstar med god frysbarhet

ii. Spermier från hingstar med dålig frysbarhet + seminalplasman från hingstar med dålig frysbarhet

iii. Spermier från hingstar med god frysbarhet + seminalplasman från hingstar med dålig frysbarhet

iv. Spermier från hingstar med dålig frysbarhet + seminalplasman från hingstar med god frysbarhet

v. Spermier från hingstar med god frysbarhet med egen seminalplasman kvar

vi. Spermier från hingstar med dålig frysbarhet med egen seminalplasman kvar

Spermiefrysning och upptining följts av mätning av spermiekvalitet, kryoöverlevnad, och befruktningsförmåga med hjälp av en heterolog zona-bindningsmetod.

Poolad SP från goda eller dåliga frysare tillsatts antigen innan frysning (Studie 1) eller efter upptining (Studie 2). Även effekterna av tillsätta ”heat shock proteins” och prostasomer till spermier utvärderades. Dessa komponenter ingår i sekret från könsvägarna hos hondjur och har visat sig öka spermiers kryoöverlevnad hos andra arter, samt förlänga spermiers överlevnad i hondjuret.

Proportionerna av heparinbindande proteiner (fertilitetsassocierade proteiner) som finns närvarande i seminalplasman av hingstar med god och dåliga frysbarhet under avelssäsongen och icke-avelssäsongen undersöktes med hjälp av Fast Protein Liquid Chromatography. Dessutom studerades proteinkompositionen av seminalplasman med hjälp av masspektrometri och western blottning, i samarbete med forskare vid franska National Institute of Agricultural Research (INRA).

Resultaten visade att borttagning av SP totalt gav bäst resultat; att tillsätta SP från hingstar med god frysbarhet gav ingen ytterligare förbättring. Att tillsätta SP innan frysning var bättre än efter upptining. Att tillsätta SP efter upptining reparerade inte kryoskador till spermier, trots att en sådan effekt har visats hos galt spermier. Bindning av spermierna till oocyter påverkas också av SP från hingstar med god frysbarhet men om detta tillsättas innan frysning kan behandlade spermierna behöva mer tid för kapacitering innan befruktning.

Angående proteiner i seminalplasman, fosforylkolinbindande proteiner var den vanligaste kategorin i prover från både god och dåliga frysare. Det var en signifikant skillnad i förhållandet mellan icke-heparinbindande proteiner och totala proteiner mellan goda och dåliga frysare på avelssäsongen jämfört med icke-avelssäsongen. Den flesta infrysningen sker under icke avelssäsongen pga att sperma behövs för kyld och färsk spermadoser under avelssäsongen.

Skillnader hittades i nivåerna av 33 proteiner mellan de två grupperna. Seminalplasman från hingstar med god frysbarhet hade höga halter av antioxidanter (t ex katalas och superoxiddismutas) och motilitetsstimuleranter, t.ex. aminopeptidas N, medan seminalplasman från hingstar med dålig frysbarhet hade höga nivåer av immunoglobuliner och associerade proteiner. Dessa proteiner karakteriseras vidare.

Tyvärr kunde vi inte hitta en effekt av ”heat shock protein 8” hos hingst spermier, trots att andras resultat med galt spermier kunde upprepas. När det gäller prostasomer, visade det vara svårt att förberedda prostasomer utan förorening med spermier som gjorde det svårt att tolka resultaten.

Sammanfattningsvis har resultaten av studier med seminalplasman stör betydelse för optimering av protokoll för infrysning och inseminering av hingst spermier. Rekommendationer förbereddas för hästnäring.