Forståelse av etiologien bak acquired equine polyneuropathy via studier av Schwanske celle kulturer

Summering av slutrapport

En metode for kultivering av Schwannske celler (SC) hos hest ble etablert. Cellekulturer fra 10 friske og 3 AEP hester, inklusive en med histopatologisk påviste inklusjoner, er nå nedfrosset. Flow cytometri ble brukt for å skille mellom SC og fibroblaster. Celler fra friske hester ble inkubert med serum fra friske og syke hester for å studere mulig stressrespons. Preliminære resultater indikerer større celledød med sykt serum. ELISA undersøkelser av serum fra hester på gårder med AEP viste signifikant høyere nivå av IgM antistoff mot blant annet gangliosid GM1 og GM2 enn friske kontrollhester. Vi har påvist GM1 og GM2 i SC`s membraner hos hest og gjør videre studier for påvisning av eventuelt antistoff i nerver fra AEP hester. Videre undersøkelse av vårt materiale, samt kvalitetssikring av våre foreløpige funn, vil gi nøkkelinformasjon til etiologien bak den vanligste polynevropatien hos hest i Norden.

Sammanfattning av ansökan

Acquired equine polyneuropathy (AEP) er en dramatisk nervesykdom som rammer nordiske hester. Det er påvist karakteristiske histopatologiske forandringer i de perifere nervene på hester avlivet pga sykdommen. Disse inkluderer re- og demyelinisering, samt hypertrofi av perikaria og proteinlignende inklusjoner i de myelinproduserende Schwanske cellene. Hypotesen er at en ukjent faktor, muligens fra fôret, påvirker metabolismen i de Schwanske cellene og fremkaller forandringene. Det er nødvendig med videre studier for å kunne belyse årsaksforholdene, men begrenset tilgang på prøver har vanskeliggjort dette. Prøvene må tas ut i umiddelbar tilknytning til avlivning og mange AEP affiserte hester kan ikke transporteres til patologi-enheter. Prøver som tas ut er dermed svært verdifulle. Ved å dyrke Schwanske celler i kulturer vil dette problemet omgås fordi man kan fryse og tine dem opp igjen til videre undersøkelser. Metoden er alt etablert på NMBU for hund og vil benyttes i studien på hest.

Populärvetenskaplig redovisning

For å komme nærmere etiologien bak sykdommen acquired equine polyneuropathy (AEP), var hovedmålet med prosjektet å etablere en plattform for studier av de sykelige forandringene, inkludert de spesielle inklusjonene, i de Schwannske cellene (SC) i nervene hos syke hester.

Prosjektets første delmål var å kultivere SC fra nerver fra friske hester. Vi har etablert en metode og har nå cellekulturer fra 10 friske hester nedfrosset. Vi har også lykkes med å få cellekulturer fra nerver som har blitt tatt ut så lenge som 19 timer etter avlivning. Dette muliggjør uttak under feltforhold.

Neste delmål var å kultivere SC fra hester diagnostisert med AEP. Nerveprøver fra 3 hester med tidligere gjennomgått sykdom 1 (2 hester) eller 2 (1 hest) ganger var de første som ble tatt ut. På histopatologiske undersøkelser viste alle 3 fortsatt nerveforandringer forenlig med gjennomgått AEP, men ingen inklusjoner i SC ble påvist. Kultivering av SC lyktes fra 2/3 av disse hester og er nå nedfrosset.

Det har vært en markert nedgang av registrerte AEP hester under prosjektperioden. I 2019 og 2020 ble det registrert totalt 14 affiserte hester i Norge, 8 av dem ble avlivet i akuttfasen. Vi har fått serum fra 4 av dem. I Sverige var det totalt 6 mistenkte kasus. I 2021 og 2022 ble det ikke registrert noen kasus i Norge, for første gang siden 1995. I Sverige var det totalt 4 kasus i 2022 og 2023, hvorav ett som vi fikk serum fra. Våren 2023 ble ett kasus registrert i Norge. Denne ble avlivet etter akutt forverring og nerveprøver samt serum ble tatt ut. Histopatologiske undersøkelser av nervene påviste tydelige forandringer forenlig med AEP, inkludert SC inklusjoner. Fra dette verdifulle materialet har vi nå kultivert SC og frosset de ned, i tillegg til frysesnitt og cellepellets for videre undersøkelser.

Analyse med flow cytometri ble brukt for å bekrefte identiteten til fibroblaster og SC i kulturene. Blandingskulturer (SC og fibroblaster) er naturlig i nervevev, men renere SC kulturer kan være aktuelt i noen studier. Fluorescens-aktivert cellesortering (FACS) for å separere SC fra andre celler i kulturene krever antistoff som binder spesifikt til hestevev. Dette antistoffet ble nylig tilgjengelig og kan brukes i fremtidige forsøk der renere kulturer er nødvendig.

Med immun-fluorescens og immun-elektronmikroskopi av frysesnitt har vi påvist gangliosidene GM1 og GM2 i SC`s membraner hos hest.

Vi kunne også styrke våre tidligere preliminære resultater at serum fra AEP hester og stallkamerater har et signifikant høyere nivå i blodet av IgM antistoffer mot spesifikke gangliosider, blant annet GM1 og GM2, enn hester fra staller uten AEP. Resultatene kunne bekreftes gjennom IgM-analyser av nye og gamle prøver i vår biobank med over 130 serumprøver fra AEP staller innsamlet siden 2009.

For å undersøke om serum fra AEP hester kan trigge stress respons på kultiverte SC, har celler fra friske hester blitt kultivert med serum fra henholdsvis friske respektive syke hester. Preliminære analyser med flow cytometri tyder på større andel celledød i kulturer tilsatt sykt serum. Derimot ble det ikke observert forskjell i proteinuttrykket mellom kulturene, som ble undersøkt med fluorescens mikroskopi etter merking med BiP/GRP78 antistoff.

Konklusjoner: Vi har utviklet en metode for kultivering av SC fra hest og har nå et stort materiale av friske og syke celler og serum tilgjengelig for videre studier. Flow cytometri fungerer fint for å skille mellom SC og fibroblaster. Immunfluorescence og immun-EM på frysesnitt har påvist GM1 og GM2 i SC hos hest. Det er signifikant forskjell på IgM nivået mot spesifikke gangliosider, inklusive GM1 og GM2, i serum fra AEP affiserte staller kontra uaffiserte. Funnene så langt tyder på en viktig humoral faktor i etiologien til AEP, men det trengs videre studier for å trekke konklusjoner.