Från negativ till positiv – Ny diagnostik för identifiering av etiologi vid okända virusinfektioner hos häst

Summering av slutrapport

I detta projekt användes viralmetagenomik för att identifiera virus hos hästar som lider av feber, feber kombinerad med diarré eller av neurologiska symtom. Flera virus som aldrig tidigare beskrivits i Europa upptäcktes hos hästar med feber, inkl. circovirus, torque teno-virus, copivirus och pegivirus. Virusen karaktäriserades genetiskt och qPCR-system utvecklades. Dessutom identifierades ett nytt papillomvirus samt torque teno-virus i material från hästar med neurologiska symtom. Vi visade även att Nanopore-sekvensering är ett bra alternativ till Illumina sekvensering. Denna teknik möjliggör snabb och realtidsbaserad annotering av virala metagenom från hästar utan behov av stora och kostsamma sekvenseringsutrustningar, och är därför lämplig för att undersöka akuta sjukdomsutbrott hos hästar. Vi hoppas att den kunskap som erhållits från detta projekt bidrar till att ytterligare förbättra hästars hälsa och kontrollera spridningen av dessa virusinfektioner.

Sammanfattning av ansökan

Virusinfektioner hos hästar har betydande inverkan på djurvälfärd och kan leda till stora ekonomiska förluster. Ett av de första tecknen på en virusinfektion är utvecklingen av feber och att i detta tidiga stadium kunna identifiera orsaken bakom infektionen skulle leda till snabb och korrekt behandling samt möjliggöra implementering av lämpliga biosäkerhetsåtgärder för att stoppa ytterligare spridning. Men feber och andra kliniska symptom på viral infektion, t.ex. neurologiska störningar, förblir ofta odiagnostiserade. Därför kommer vi i denna studie använda metagenomik för att undersöka den virala orsaken bakom feberfall hos svenska hästar samt bakom neurologiska störningar hos hästar från Sverige och från de andra nordiska länderna. Denna metod gör det möjligt för oss att identifiera alla virus som finns i ett kliniskt prov. Därmed hoppas vi att kunskapen från detta projekt kommer bidra till att förbättra hästhälsan och kontrollera spridningen av dessa virusinfektioner.

Populärvetenskaplig redovisning

Virusinfektioner hos hästar utgör ett stort problem för djurens hälsa och har betydande ekonomiska konsekvenser. Feber är ofta det första tecknet på en infektion, men att i detta tidiga skede kunna identifiera det bakomliggande viruset är en utmaning. Det försvårar inte bara behandlingen utan hindrar också möjligheten att snabbt införa biosäkerhetsåtgärder för att förhindra vidare smittspridning. För att möta dessa utmaningar har vi i denna studie använt virusmetagenomik för att undersöka orsakerna bakom feber och neurologiska störningar hos hästar. Denna teknik gör det möjligt att identifiera samtliga virus i ett prov utan att behöva veta vilka virus man letar efter.

Totalt provtogs 275 hästar, uppdelade i fyra grupper: hästar med feber, hästar med feber och diarré, hästar med neurologiska symtom samt en kontrollgrupp med hästar utan tecken på infektion. Från dessa hästar samlades blodprover och nässvabbar in. För de med diarré togs även avföringsprover, och i ett fall från gruppen med neurologiska symptom undersöktes hjärnvävnad. Proverna genomgick flera steg, däribland filtrering för att avlägsna bakterier, extraktion av genetiskt material och storskalig sekvensering. Utöver metagenomiken användes kvantitativ PCR (qPCR) för att screena proverna för specifika virus.

Resultaten visade att flera kända och tidigare okända virus förekom hos hästarna. Bland de vanligaste virusen i hästar med feber var ekvina herpesvirus (EHV-2 och EHV-5), vilka också påträffades i vissa prover från friska kontrollhästar. Intressant var att vi även identifierade virusmedlemmar ur familjerna Flaviviridae, Anelloviridae, Parvoviridae och Circoviridae av vilka merparten endast har identifierats tidigare i USA. Eftersom dessa virus inte beskrivits här tidigare så har vi genetiska karakteriserat deras arvsmassa. Genom qPCR analyser observerade vi att 1.6% - 9.4% av hästarna som analyserats var positiva för dessa olika virus. För circovirus och anelloviruset observerades en högre positivitet hos hästar med feber.

För hästar med både feber och diarré identifierades främst ekvint coronavirus. Detta virus är sedan tidigare känt för att ge upphov till liknande symtom hos hästar världen över. Dessutom upptäcktes virussekvenser med låg likhet till kända picornavirus, vilket indikerar förekomsten av potentiellt nya, ännu oidentifierade virus. Dessa fynd behöver dock vidare studeras för att kunna karaktärisera deras arvsmassa.

Bland hästar med neurologiska symtom identifierades ett nytt ekvint papillomavirus. Även om detta virus sannolikt inte är direkt kopplat till symtomen valde vi att genetiskt karaktärisera det, då det visade sig vara så pass olikt andra kända virus att det förmodligen representerar ett nytt genus. Dessutom påträffades ekvint torque teno virus i hjärnvävnad från en av dessa hästar. Detta fynd är intressant eftersom viruset aldrig tidigare identifierats i hjärnan hos häst. Liknande virus har dock påträffats hos människor i samband med encefalit, vilket väcker nya frågor om dess möjliga roll i neurologiska sjukdomar.

För att stärka diagnostiska verktyg vid akuta virusutbrott av häst och möjliggöra analys på labb utan tillgänglig stor och dyra sekvenseringsutrustning testades Nanopore (MinION) sekvensering. MinION är en liten portabel sekvensator som kan kopplas in till en dator via USB och där dess resultat kan fås i realtid. Resultaten visar att denna metod är både effektiv och känslig, och den kan inte bara identifiera virus utan också genetiskt karaktärisera dem. Vi anser således att den är särskilt användbar för att undersöka akuta sjukdomsutbrott hos hästar.

Sammanfattningsvis har denna studie ökat förståelsen av virusinfektioner hos hästar. Genom att kombinera avancerad teknologi med omfattande analyser har nya virus kunnat identifieras, och insikter har vunnits om deras spridning och möjliga kopplingar till sjukdom. Vi har även visat på potentialen av att använda MinION som ett komplimenterande diagnostiskt verktyg inom hästsjukvården.